一(yī)，菌(jūn)落染(rǎn)色法
在(zài)含有氧(yǎng)化還原顯(xiǎn)，色試(shì)劑(jì)四(sì)唑(zuò)嗡紫羅蘭(lán)等的(dí)瓊脂平板培(péi)養基(jī)上(shàng)培養微生物(wù)，或者(zhě)在普通(tōng)的瓊脂(zhī)平板培養基(jī)上培養(yǎng)後，經過染(rǎn)色(sè)，很(hěn)容易判(pàn)別(bié)菌落是(shì)一種(zhǒng)比(bǐ)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)時間(jiān)更(gēng)短(duǎn)的(dí)計測菌落(là)的方(fāng)法(fǎ)。
微(wēi)觀染(rǎn)色(sè)用於(yú)對(duì)培(péi)養(yǎng)結束的膜過(guò)濾(lǜ)器直(zhí)接(jiē)滴(dī)下(xià)染色液，然(rán)後讓(ràng)其(qí)幹(gān)燥(zào)，將染(rǎn)成青色的(dí)菌落拿(ná)到10～20倍的放(fàng)大(dà)鏡(jìng)下(xià)進行計測(cè)。培養時間可以縮(suō)短到原(yuán)來方法的(dí)1/4～1/2。
二，阻抗法
微生物(wù)在(zài)增殖過程中會(huì)將蛋(dàn)白(bái)質，碳(tàn)水(shuǐ)化合物等(děng)高分(fēn)子(zǐ)化合物，分解成有(yǒu)機(jī)酸，氨(ān)基(jī)酸等離子化合(hé)物，這些離子化合(hé)物(wù)達到(dào)一(yī)定濃度，在(zài)周圍(wéi)環(huán)境(jìng)中將(jiāng)產(chǎn)生(shēng)微小的電量(liáng)變化(huà)。將這(zhè)個(gè)電量的變(biàn)化利用電(diàn)阻(zǔ)，導(dǎo)電(diàn)性或者靜(jìng)電容(róng)量(liáng)這些(xiē)概念(niàn)檢(jiǎn)測(cè)的方法，稱為阻抗法(fǎ)。產生(shēng)電(diàn)量(liáng)與(yǔ)開(kāi)始時的細(xì)菌(jūn)數，菌的增(zēng)殖(zhí)性成反比。因此，從預先求得(dé)的兩(liǎng)者的(dí)標(biāo)準曲綫中可以推算出樣品(pǐn)中(zhōng)初(chū)始的細菌(jūn)數。作為(wéi)產品(pǐn)化(huà)的(dí)係統有氣壓（或液(yè)壓(yā)）傳(chuán)輸係統(tǒng)以及(jí)細(xì)菌計(jì)數器。
實際(jì)操作(zuò)如下(xià)：往容(róng)器中(zhōng)添加液(yè)體培養基和(hé)樣品(pǐn)，放(fàng)在組(zǔ)成(chéng)係統的培(péi)養裝置中(zhōng)開始培養。測定機(jī)逐時(shí)的自動監測培養過(guò)程(chéng)中電(diàn)量(liáng)的變化。
本測(cè)定方(fāng)法(fǎ)必須培養，但它(tā)和原來(lái)計測(cè)菌(jūn)落的方法(fǎ)相(xiāng)比，優(yōu)點(diǎn)在於(yú)培養時間(jiān)可(kě)以(yǐ)縮短。培(péi)養(yǎng)開(kāi)始後直到結(jié)果的打印輸出*自動化(huà)，初始(shǐ)投(tóu)資高但(dàn)運(yùn)行(háng)費用低。另外(wài)，通(tōng)過組(zǔ)合選(xuǎn)擇性培(péi)養(yǎng)基(jī)，可(kě)應(yīng)用(yòng)於檢測(cè)特(tè)定微(wēi)生(shēng)物。
三(sān)，氧(yǎng)化電極(jí)法(fǎ)
氧化(huà)電極法(fǎ)是(shì)一種將微生物增殖(zhí)過(guò)程(chéng)中的呼(hū)吸活性通過氧化電極檢出的方(fāng)法(fǎ)。與阻抗(kàng)法(fǎ)一樣，通過(guò)自動監測(cè)，逐時的測定隨(suí)培(péi)養進度而(ér)產(chǎn)生(shēng)的(dí)培(péi)養基(jī)中溶解(jiě)氧的濃度(dù)，直到(dào)能夠檢出呼(hū)吸活性的(dí)培養(yǎng)時間，從這(zhè)一時間(jiān)推算(suàn)樣品(pǐn)中的開(kāi)始菌(jūn)數。測(cè)定時，向裝(zhuāng)有氧化極(jí)的容器中(zhōng)添(tiān)加(jiā)液(yè)體培養基和樣品，然後(hòu)放在組(zǔ)成係(xì)統的培(péi)養裝(zhuāng)置(zhì)中(zhōng)開(kāi)始(shǐ)培(péi)養(yǎng)，測定機自動(dòng)監(jiān)測培(péi)養(yǎng)基中溶解氧濃(nóng)度的(dí)逐時變(biàn)化。6h內就可(kě)以檢(jiǎn)出105CFU/g的開(kāi)始菌(jūn)數(shù)。
四，顯色(sè)法
顯色法(fǎ)是一(yī)種(zhǒng)通過標識色(sè)素(sù)的色調變(biàn)化來檢測隨微(wēi)生(shēng)物代(dài)謝(xiè)產生(shēng)的培(péi)養基(jī)pH值的變(biàn)化(huà)和CO₂生成的方法。通過(guò)自(zì)動(dòng)監(jiān)測檢測(cè)出培養過(guò)程中(zhōng)標(biāo)識色素的(dí)色(sè)調變化，從(cóng)直到可(kě)以檢(jiǎn)測出色調變(biàn)化的這一段培(péi)養(yǎng)時(shí)間推算出(chū)樣(yàng)品(pǐn)中(zhōng)的(dí)開(kāi)始菌數。以(yǐ)培養(yǎng)基pH值(zhí)變(biàn)化為指(zhǐ)標的(dí)維夫斯，以CO_{2生成為指(zhǐ)標(biāo)的敏化培(péi)養基/生物(wù)材料(liào)20都已產品化。
維(wéi)夫(fū)斯使(shǐ)用(yòng)容器(qì)，此(cǐ)容器中(zhōng)盛(shèng)有包含標(biāo)識色素的瓊脂層與(yǔ)液(yè)體(tǐ)培養基。使用(yòng)時(shí)，向(xiàng)容器中(zhōng)添加樣品(pǐn)，放入組成(chéng)係統的(dí)培(péi)養(yǎng)裝置中(zhōng)開(kāi)始培養。檢出(chū)時間(jiān)受開(kāi)始(shǐ)菌數(shù)多(duō)少的影響(xiǎng)，但(dàn)如(rú)果達到(dào)106CFU，7個(gè)小(xiǎo)時就(jiù)可以檢(jiǎn)出。通過(guò)組合(hé)選擇性(xìng)培養基，也(yě)可(kě)應用於特定(dìng)微生物(wù)的(dí)檢(jiǎn)出(chū)。}
以(yǐ)上四(sì)種方(fāng)法仍需培養(yǎng)，隻(zhī)是培養時(shí)間較傳統(tǒng)方(fāng)式縮短(duǎn)，有助於改善生物汙染控(kòng)製的(dí)工作效(xiào)率，屬於一類。以下(xià)幾種方法(fǎ)則無需培(péi)養，屬於另一類(lèi)環(huán)境(jìng)微生物快速(sù)測(cè)定法。
五(wǔ)，熒(yíng)光染色(sè)法(fǎ)
利(lì)用(yòng)熒光染色(sè)劑熒(yíng)光染色細(xì)胞膜(mó)和(hé)細(xì)胞核等，使(shǐ)用(yòng)熒(yíng)光(guāng)顯微鏡等(děng)將細(xì)菌檢出(chū)的(dí)方法。染色機(jī)理不同(tóng)的(dí)多種(zhǒng)熒(yíng)光(guāng)染色劑(jì)，根(gēn)據(jù)不(bù)同的(dí)組(zǔ)合(hé)也(yě)能識別出活(huó)菌(jūn)和(hé)死(sǐ)菌(jūn)。染(rǎn)色掃(sǎo)描RDI及D計(jì)數，真菌監視器(qì)掃描(miáo)，生物(wù)絮凝(níng)等都已(yǐ)產品化(huà)。
染色(sè)掃(sǎo)描RDI在(zài)薄膜過濾(lǜ)器上過濾(lǜ)樣品，熒(yíng)光(guāng)染(rǎn)色阻擋(dǎng)在(zài)薄膜(mó)過濾(lǜ)器(qì)上的微生(shēng)物後，再(zài)進行激光(guāng)掃描。熒光染色(sè)的30min，激光掃(sǎo)描3min即可結束(shù)。其(qí)結果可(kě)以作為圖(tú)像表(biǎo)示在監測器畫麵上，也可(kě)以(yǐ)自動(dòng)計(jì)測產(chǎn)生熒光的點(diǎn)數。D計數以(yǐ)及真菌監(jiān)視(shì)器掃描(miáo)是結合了熒光染色(sè)法(fǎ)與(yǔ)流體檢(jiǎn)查(chá)計(jì)數法(fǎ)的方(fāng)法，可以(yǐ)連續(xù)測(cè)定液態(tài)樣(yàng)品。
六，LAL試(shì)驗法
LAL試(shì)驗(yàn)法(fǎ)是利用(yòng)鱟屬的血(xiě)球抽(chōu)出(chū)物，檢測(cè)來源於(yú)革(gé)蘭(lán)氏陰性菌(jūn)的內毒(dú)素(sù)的方法(fǎ)。內毒素(sù)是(shì)革蘭(lán)氏(shì)陰(yīn)性(xìng)菌細(xì)胞壁成分(fēn)的(dí)脂多(duō)糖，可以(yǐ)作(zuò)為革蘭氏陰性(xìng)菌(jūn)的指(zhǐ)標。
七，SLP試驗(yàn)法
SLP試驗(yàn)法(fǎ)是(shì)利用蠶血液(yè)成(chéng)分檢(jiǎn)出肽聚糖(táng)及(jí)β-葡聚糖(táng)的(dí)方法。肽聚糖是細菌的細胞壁成本，β-葡聚(jù)糖是(shì)真菌的(dí)細胞壁成分(fēn)。因此，通過本試驗(yàn)法能夠檢出(chū)這些微(wēi)生(shēng)物。不過(guò)，每個微(wēi)生物的(dí)肽(tài)聚(jù)糖及β-葡聚(jù)糖含量(liáng)因(yīn)菌(jūn)株不(bù)同而差異(yì)很(hěn)大，與LAL試(shì)驗法(fǎ)一樣(yàng)，不能定量微生物，而(ér)且也(yě)不能(néng)識別(bié)出式來(lái)源於(yú)活(huó)菌還是死菌(jūn)。
八，ATP快(kuài)速測定法
ATP是高能磷酸化(huà)合(hé)物(wù)，分(fēn)解時產(chǎn)生的(dí)能(néng)量用(yòng)於細胞內(nèi)各種(zhǒng)有能量(liáng)需(xū)求的反應。即ATP在(zài)地(dì)球(qiú)上(shàng)所有活(huó)著的(dí)細(xì)胞內發揮著類似(sì)於(yú)電(diàn)池的(dí)功能(néng)，它的(dí)存在(zài)成(chéng)為生命活(huó)動(dòng)的(dí)證據。
（1）ATP法的(dí)測(cè)定(dìng)原理(lǐ)
ATP法是利用螢(yíng)火蟲尾部發光(guāng)反(fǎn)應(yīng)的微生物測(cè)定法。來(lái)源於螢(yíng)火蟲(chóng)的熒光素酶(méi)催化(huà)反應(yīng)，以(yǐ)高(gāo)量子收獲(huò)率變換(huàn)具有(yǒu)ATP的化(huà)學能源(yuán)而發(fā)光。反(fǎn)應(yīng)結果(guǒ)產生的光的數量即發光量和(hé)ATP量成正比(bǐ)，通(tōng)過(guò)測(cè)定(dìng)發(fā)光量就(jiù)可以(yǐ)定量ATP。ATP不(bù)但存在於細菌(jūn)體內，而(ér)且廣泛存在(zài)遊離(lí)於細(xì)菌體外的(dí)狀態。細(xì)菌外ATP是指從活細菌中(zhōng)溶(róng)析出(chū)來(lái)，細菌死時(shí)被逐出(chū)，而(ér)且(qiě)被包含(hán)在有機(jī)汙染中。細菌(jūn)外ATP影響(xiǎng)活菌數的(dí)測(cè)定，因(yīn)此在(zài)前處(chǔ)理階(jiē)段必須除去。另一方麵，驗證潔淨度(dù)時，用細(xì)菌(jūn)內(nèi)外ATP量的(dí)總(zǒng)和（ATP總量(liáng)）為汙染指標(biāo)的方法，在能(néng)夠檢出微生物(wù)及(jí)其(qí)溫(wēn)床汙染兩個(gè)方(fāng)麵的意(yì)義上是(shì)合理(lǐ)的。ATP法操作(zuò)簡單且(qiě)能(néng)快(kuài)速得(dé)到(dào)結果。
（2）以(yǐ)菌體(tǐ)內ATP量為(wéi)指(zhǐ)標(biāo)測定(dìng)活(huó)菌(jūn)數
根據(jù)ATP法求(qiú)活菌數(shù)時，在前處理階(jiē)段(duàn)必須除去細(xì)菌體外(wài)的(dí)ATP。除去(qù)ATP的方法有(yǒu)酶(méi)化分解消去法(fǎ)和薄膜過(guò)濾(lǜ)器過濾(lǜ)除去法(fǎ)。酶化法原(yuán)則(zé)上能適用(yòng)於各種樣品(pǐn)，但(dàn)含有(yǒu)高濃度(dù)的蛋白(bái)質(zhì)和脂(zhī)肪(fáng)的(dí)樣品(pǐn)，有時(shí)不能充分除(chú)去(qù)細(xì)菌(jūn)體(tǐ)外的ATP，測試前(qián)必須(xū)確認去(qù)除(chú)效(xiào)果。而薄(báo)膜過濾(lǜ)器(qì)法(fǎ)不(bù)能用(yòng)於引(yǐn)起堵塞的(dí)樣(yàng)品(pǐn)，但它不(bù)僅可(kě)以除去細(xì)菌(jūn)外(wài)的(dí)ATP，而(ér)且還可以除去(qù)妨礙(ài)發光反應(yīng)的物(wù)質，進(jìn)而(ér)使(shǐ)微(wēi)生(shēng)物濃縮(suō)，有助於(yú)測試。
（3）空氣中浮(fú)遊菌(jūn)數的(dí)測(cè)定(dìng)
用(yòng)空(kōng)氣(qì)取樣器將(jiāng)空(kōng)氣(qì)中(zhōng)浮遊(yóu)菌(jūn)捕集(jí)到瓊脂(zhī)培養基上進(jìn)行培養之前，與(yǔ)原來方法相同。原(yuán)來方法(fǎ)是(shì)培(péi)養2天後(hòu)計測出現的菌落，與此相(xiāng)對(duì)，利用ATP法(fǎ)檢測(cè)細(xì)菌成(chéng)功的將培養(yǎng)時間縮短到(dào)6h。
根(gēn)據NASA標(biāo)準，在ISO 8級食品(pǐn)廠的(dí)潔(jié)淨(jìng)室(shì)，取(qǔ)樣(yàng)空氣量為10ft³的條(tiáo)件下，探討與原來方(fāng)法的(dí)相(xiāng)關性。兩測(cè)定值(zhí)具有(yǒu)相關性，但其(qí)相(xiāng)關性很小，隻能推算出大(dà)致的(dí)空(kōng)氣(qì)中浮遊菌數。一般認為(wéi)這(zhè)是由(yóu)於(yú)多種微(wēi)生(shēng)物浮遊(yóu)於(yú)空氣中，各種微生(shēng)物(wù)增殖(zhí)速度(dù)和(hé)ATP含量不(bù)同的(dí)緣故。但(dàn)是，雖不能準(zhǔn)確(què)求出(chū)細(xì)菌數，也(yě)可用於判定(dìng)級別等某(mǒu)種(zhǒng)程度上放(fàng)寬範圍的評價(jià)。